NMR

Nukleární magnetická rezonance (NMR) je spektroskopická technika, kterou lze použít k vyvolání strukturních a dynamických vlastností molekul využitím chování určitých atomů, jsou-li umístěny ve velmi výkonných supravodivých magnetech (180 000 až 360 000krát silnějších než zemské magnetické pole pro magnety v centru UConn Health). Pokud jsou NMR aktivní jádra umístěna do silného magnetického pole, jejich jádra se vyrovnají s polem a začnou zpracovávat na frekvenci závislé na gyotomickém poměru izotopů a síle aplikovaného magnetického pole, spolu s chemickým a fyzickým prostředím atomu . Složka frekvence, která je závislá na chemickém a fyzickém prostředí, se nazývá chemický posun. Experimenty NMR narušují vyrovnání pomocí krátkých pulzů vysokofrekvenční (RF) energie, což umožňuje určit chemický posun každého z aktivních atomů NMR ve zkoumané molekule. Použitím kombinací pulzů a zpoždění (toto se označuje jako sekvence pulzů) lze zjistit další informace, například to, které atomy jsou navzájem spojeny a které atomy jsou prostorově blízko sebe. Využitím mnoha různých experimentů je možné určit trojrozměrnou strukturu molekul, včetně velkých biomolekul, jako jsou proteiny.

Zkoumání pomocí NMR vysokého rozlišení je proveditelnější u proteinů s hmotností menší než přibližně 25 kDa a rozpustné na přibližně 0,5 mM. V určitých případech je možné zkoumat proteiny nebo komplexy s větší velikosti či nižší rozpustností. Membránové proteiny je obtížné zkoumat pomocí metod s vysokým rozlišením, objevují se však nové techniky, které mohou být použitelné. Protože studie NMR obvykle vyžadují značení, musí být k dispozici protein se stabilními izotopy 15N, 13C a někdy 2H (expresní systém vhodný pro růst ve značeném médiu). Proteiny se musí purifikovat (obvykle je vyžadováno > 95 %) a skládat a musí být alespoň okrajově stabilní. Doporučuje se předběžná charakterizace cirkulárním dichroismem a tepelnou nebo rozpouštěcí denaturací.

Na tuto otázku je těžké odpovědět, protože závisí na položených otázkách a chování vzorku. Obvykle je zapotřebí 300 µl (se speciálními zkumavkami NMR) na 600 µl vzorku. Koncentrace proteinů pro dobře fungující systémy by měly být vyšší než 150 µM pro strukturální studie, pro jiné nestrukturální studie však lze použít nižší koncentrace. I když 150 µM je hrubý odhad pro nejnižší koncentraci, která se použije pro strukturní studie, je vhodné, aby byly koncentrace proteinu co nejvyšší a měly by být omezeny rozpustností a chováním proteinu, nikoli množstvím připraveného proteinu. Doba potřebná k provedení delších experimentů za účelem kompenzace nízkých koncentrací a prodloužená doba k interpretaci NMR spekter bude téměř jistě delší než doba potřebná k přípravě dalšího vzorku.

Jakmile je vzorek dostatečně vyčištěn a vysušen, dalším krokem je výběr vhodného rozpouštědla. Vzhledem k tomu, že deuterium je zdaleka nejznámějším lock jádrem, je vzorek obvykle rozpuštěn v deuterovaném rozpouštědle (deuterované rozpouštědlo je rozpouštědlo, ve kterém byla velká část, obvykle více než 99%, atomů vodíku nahrazena deuteriem). Běžně používanými deuterovanými rozpouštědly jsou aceton-d6, benzen-d6 a chloroform-d, ačkoli je k dispozici celá řada dalších rozpouštědel.

Při výběru rozpouštědla je třeba vzít v úvahu tyto faktory:

1. Rozpustnost:

• Je zřejmé, že čím více je vzorek rozpustný, tím je lepší. Tím se maximalizuje množství vzorku v citlivém objemu, což zvyšuje citlivost experimentu. Vysoká rozpustnost je zvláště důležitá, pokud je k dispozici pouze malé množství vzorku.

2. Interference signálů rozpouštědla se spektrem vzorku

• Samotné rozpouštědlo bude nevyhnutelně produkovat NMR signály, které zakryjí oblasti spektra. Tyto „píky zbytkového rozpouštědla“ by se neměly překrývat se signály ze vzorku.

3. Závislost na teplotě:

• U experimentů v podmínkách nad nebo pod hodnotou pokojové teploty jsou důležitými faktory také teploty tání a varu rozpouštědel. Dále je pravděpodobné, že se rozpustnost vzorku bude měnit s teplotou.

4. Viskozita:

• Čím nižší je viskozita rozpouštědla, tím lepší je výsledek experimentu.

5. Náklady:

• Je zřejmé, že pro rutinní NMR, kde je třeba měřit mnoho vzorků, jsou důležitým faktorem náklady na rozpouštědlo. Cena se zpravidla zvyšuje s počtem deuterovaných atomů.

6. Obsah vody:

• Téměř všechna rozpouštědla NMR obsahují stopy vody. Řada z nich jsou také hygroskopické (absorbují vodu z atmosféry), a proto platí, že čím déle jsou skladovány, tím více vody obsahují. Přítomnost píku vody (HDO) bude sloužit pouze ke snížení kvality NMR spekter. Hladinu vody v rozpouštědle lze značně snížit filtrací přes sušidlo nebo skladováním rozpouštědla na molekulárních sítech.
• Výběr rozpouštědla pro konkrétní vzorek bude představovat nejlepší kompromis mezi různými výhodami a nevýhodami každého z nich. Přesné podrobnosti o konkrétních rozpouštědlech najdete v textu týkajícím se standardní NMR.